Thượng viện họp ban đầu, hầu như bí mật, trên tầng hai của Hội trường Liên bang ở Thành phố New York trong một căn phòng không có mặt của khán giả dự thính. Trong 5 năm, không có ghi chép nào được công bố về các thủ tục của Thượng viện.

Một vấn đề thủ tục của Thượng viện thời kỳ đầu là vai trò của Phó Tổng thống tại Thượng viện, theo hiến pháp đồng thời làm Chủ tịch cơ quan này. Phó Tổng thống ban đầu được phép tham giá quá trình xây dựng luật pháp và tham gia vào các cuộc tranh luận, nhưng những quyền đó đã bị tước đi tương đối nhanh chóng. John Adams, Phó Tổng thống đầu tiên, hiếm khi bỏ lỡ bất cứ một phiên họp nào, nhưng các Phó Tổng thống sau này rất ít khi tham dự Thượng viện, và chỉ tham dự vào các nghi lễ hoặc cần bỏ phiếu phá vỡ thế hòa. Mặc dù những Cha sáng lập dự định Thượng viện là cơ quan lập pháp với các tiến trình chậm hơn, nhưng trong những năm đầu của đất nước, chính Hạ viện đã mất thời gian để thông qua luật, do các Dân biểu gặp khó khăn trong việc di chuyển và ở hạ viện có sự chia rẽ về đảng phái hơn Thượng viện. Hệ thống Ngân hàng và Dự luật Giả định do Bộ trưởng Ngân khố Alexander Hamilton giới thiệu, cả hai đều gây tranh cãi, dù dễ dàng thông qua ở Thượng viện, nhưng vấp phải sự phản đối ở Hạ viện.

Năm 1797, Thomas Jefferson bắt đầu truyền thống rằng Phó Tổng thống chỉ tham dự các phiên họp của Thượng viện vào những dịp đặc biệt. Mặc dù vắng mặt thường xuyên, Jefferson đã ghi dấu ấn của mình với cuốn sách về chương trình nghị sự tại Thượng viện: Sổ tay Hướng dẫn Nghị viện về Sử dụng Thượng viện Hoa Kỳ đến nay vẫn được sử dụng.

Những thập kỷ trước Nội chiến Hoa Kỳ được coi là "Thời kỳ hoàng kim" của Thượng viện. Với sự ủng hộ của dư luận và Tổng thống Jefferson, vào năm 1804, Hạ viện đã bỏ phiếu để luận tội Thẩm phán Tòa án Tối cao Samuel Chase với tỷ lệ phiếu 73–32. Tuy vậy, Thượng viện đã bỏ phiếu tha bổng cho Chase với tỷ lệ phiếu 18–16.

Thượng viện được miêu tả với những điều tốt nhất từ Aaron Burr, người với tư cách là Phó Tổng thống chủ trì phiên tòa luận tội. Vào cuối phiên tòa, Burr nói:

Thượng viện là một nơi tôn nghiêm; một tòa thành của luật pháp, trật tự và tự do; và dù ở bất cứ đâu, nó luôn có khả năng chống lại những cơn bão của chính trị và nghệ thuật tham nhũng thầm lặng.

— Aaron Burr, Phó Tổng thống Hoa Kỳ thứ ba, [10]

Ngay cả nhiều nhà phê bình cũng thừa nhận rằng Burr đã chủ tọa phiên tòa một cách hết sức nghiêm túc và công bằng.

Trong vài thập kỷ tiếp theo, Thượng viện đã trở lên nổi bật ở Hoa Kỳ. John C. Calhoun, Daniel Webster, Thomas Hart Benton, Stephen A. Douglas và Henry Clay đã làm lu mờ một số tổng thống. Ngài Henry Maine gọi Thượng viện là "cơ quan thành công triệt để duy nhất đã được thành lập kể từ khi làn sóng dân chủ hiện đại bắt đầu trỗi dậy." Thủ tướng Anh William Ewart Gladstone nói rằng Thượng viện Hoa Kỳ là “cơ quan đáng chú ý nhất trong tất cả các phát minh của chính trị hiện đại." [11]

Một trong số các cuộc tranh luận lớn nhất trong lịch sử Thượng viện là cuộc tranh luận giữa Webster–Hayne vào tháng 1 năm 1830, phân chia lợi ích của Daniel Webster ở New England và của Robert Y. Hayne ở miền Nam.

Trong những thập kỷ trước Nội chiến, Liên bang đã có hai cuộc tranh cãi gay gắt về sự cân bằng Bắc–Nam tại Thượng viện (miền Bắc gồm những bang bãi nô và miền Nam gồm những bang ủng hộ chế độ nô lệ). Kể từ khi chế độ nô lệ bị bãi bỏ ở miền Bắc qua đường Mason – Dixon, số lượng các tiểu bang nô lệ và tự do luôn bằng nhau. Trong Thỏa hiệp Missouri năm 1820, do Henry Clay làm trung gian, Maine tách khỏi Massachusetts để gia nhập Liên bang với tư cách một bang tự do để đối trọng với Missouri. Thỏa hiệp năm 1850, do Henry Clay và Stephen Douglas làm trung gian, một lần nữa giúp trì hoãn Nội chiến.