Thí nghiệm Nirenberg và Matthaei là một thí nghiệm hóa sinh được thực hiện vào tháng 5 năm 1961 bởi Marshall W. Nirenberg và nghiên cứu sinh hậu tiến sỹ của ông là J. Heinrich Matthaei. Kết quả của thí nghiệm đã giải mã được bộ ba mã hóa (codon) đầu tiên trong 64 bộ ba của mã di truyền bằng cách sử dụng polyme thuần nhất với đơn phân axit nucleic để dịch mã ra axit amin tương ứng.Trong thí nghiệm, họ chuẩn bị một phần chiết từ các tế bào của vi khuẩn mà có thể tổng hợp ra protein ngay cả khi không có tế bào nguyên vẹn còn sống nào. Sau đó thêm vào phân tử tổng hợp nhân tạo RNA chứa toàn bộ nucleotideuracil, hay axit polyuridylic (còn gọi là poly-U), vào hỗn hợp chứa phần chiết này để quan sát kết quả tổng hợp từ mẫu RNA trên tạo ra protein chứa toàn bộ axit amin phenylalanine. Thí nghiệm này đã giải mã codon đầu tiên (UUU) của mã di truyền và chứng tỏ RNA kiểm soát quá trình sinh tổng hợp protein.
