Cùng với Bill Gates, ông đã thành lập Microsoft (ban đầu là "Micro – Soft") tại Albuquerque, New Mexico, năm 1975, và bắt đầu bán ngôn ngữ lập trình thông dịch BASIC. Năm 1980, Allen là người đầu tiên mở đầu cho sự đi lên của khi mua lại hệ điều hành có tên là QDOS với giá 50.000 đô la Mỹ. Theo hạn chót của IBM, Gates và Allen cảm thấy họ không có đủ thời gian để phát triển một hệ điều hành mới; do đó họ đã mua lại QDOS với chức năng hoàn chỉnh và sửa lại mã nguồn để phù hợp với yêu cầu của IBM. Microsoft đã thắng được hợp đồng cung cấp chương trình hoàn thiện để sử dụng làm hệ điều hành trong loạt máy để bàn mới của IBM. Nó đã trở thành nền tảng cho sự phát triển của Microsoft.

Allen từ chức khỏi Microsoft vào năm 1983 sau khi bị chẩn đoán mắc bệnh Hodgkin, sau đó đã được chữa trị thành công sau vài tháng chữa trị bằng phóng xạ và ghép thần kinh xương.

Vào tháng 11 năm 2000, Allen rút khỏi ban quản trị của Microsoft nhưng được nhờ tư vấn với vị trí cố vấn chiến lược cấp cao của ban điều hành công ty. Ông đã thậm chí nới rộng hơn khoảng cách giữa mình với Microsoft với việc bán 68 triệu cổ phiếu của Microsoft. Có người nói ông hiện vẫn còn sở hữu khoảng 138 triệu cổ phiếu.