Sắp xếp thẳng hàng trình tự (tiếng Anh là sequence alignment) là phương pháp sắp xếp hai hoặc nhiều trình tự nhằm đạt được sự giống nhau tối đa. Các trình tự này có thể được xen bằng các khoảng trống (thường được diễn tả bằng các gạch nối ngang) tại các vị trí có thể để làm sao tạo thành các cột giống nhau (identical) hoặc tương tự nhau (similar).Phương pháp này thường được dùng để nghiên cứu sự tiến hóa của các trình tự từ một tổ tiên chung, đặc biệt là các trình tự sinh học như trình tự protein hoặc trình tự DNA. Các bắt cặp không đúng trong trình tự tương ứng với các đột biến và các khoảng trống tương ứng với phần thêm vào hoặc xóa đi. Cũng có thể sử dụng sắp xếp thẳng hàng trình tự để nghiên cứu nhiều vấn đề khác như sự tiến hóa ngôn ngữ và độ tương đồng trong các văn bản.Thuật ngữ "sắp xếp thẳng hàng trình tự" cũng chỉ quá trình tạo ra sự sắp xếp này hay tìm ra các cách sắp xếp tốt nhất trong cơ sở dữ liệu gồm các trình tự riêng biệt.